1978年考入宜昌市京剧团学员班，由靳万春开蒙，学老旦。1980年入湖北省戏曲学校向刘煜老师学习。1983年拜李金泉为师。1987年考入中国戏曲学院表演系大专班继续深造。从李金泉、杨韵清、孔雁等老师学习。学习了《李逵探母》、《罢宴》、《徐母骂曹》、《滑油山》等诸多传统剧目，打下了基础。1990年毕业留校在实验剧团任演员。1990年在纪念徽班进京200周年时，演出了新编古代剧《契丹英后》，受到好评。1993年调入中国京剧院。在现代戏《北国红姑娘》中扮演朝鲜族妇女安顺福。
曾荣获2000年文化部全国京剧优秀青年演员评比展演一等奖，2001年全国青年京剧演员电视大奖赛最佳表演奖，梅花奖等。
在2008年5月5日袁慧琴在国家大剧院举行个人演唱会，这是第一位在国家大剧院开“个唱”的京剧演员。
2008年初中央电视台电影频道播出戏曲电影《对花枪》，其中一个24分钟的长镜头引起在场专家惊叹，这样的长镜头在中国戏曲电影史上还是首次。她的唱腔吐字清楚、喷口有力、行腔流畅、韵味醇厚，让人听起来仿佛有穿云贯石的力度和气势！
